大鼠骨髓及人脐带间充质干细胞对模型鼠尿失禁的修复研究
2017-11-6 10:40:19 http://www.biog.org.cn 来源：北京妇产学会
姚润斯 罗 新* 张 仙 范 瑾 帅翰林 蒋学风 李瑞满
（暨南大学附属第一医院妇产科，广东 广州，510630）
【摘要】
目的：1. 探讨17β-雌二醇(17β-E2)对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells ,BMSCs)增殖﹑成肌分化的影响，为压力性尿失禁的细胞治疗提供理想的细胞源。
2.建立模拟人类分娩损伤、多产、密产、绝经后大鼠，并研究上述因素与压力性尿失禁发生的关系。3.观察SUI模型大鼠尿道周围组织、肛提肌组织形态学改变，探讨慢性损伤所致的盆底支持组织的改变是压力性尿失禁的病因之一。4.研究大鼠骨髓间充质干细胞和人足月分娩脐带中间充质干细胞的体外传代培养方法，并研究其生物学特性。通过对两种间充质干细胞标记，为细胞治疗的研究提供理想的识别方法。5.将获得的标记间充质干细胞注射于SUI大鼠后尿道周围组织，依据尿流动力学指标、喷嚏实验阳性率、尿道和尿道周围组织显微镜下形态学改变，验证移植间充质干细胞于模型大鼠后尿道来治疗压力性尿失禁大鼠的有效性。方法：1.利用贴壁法体外分离、纯化BMSCs,连续传代3次；MTT法检测在0～1nmol/L浓度范围内17β-E2对BMSCs增殖活性的影响。2.Hoechst33258染色测定BMSCsDNA含量；免疫荧光法检测添加不同浓度17β-E2诱导培养后BMSCs中骨骼肌分化标志肌球蛋白重链(MHC)、myogenin、desmin表达情况。3.建立SUI模型大鼠：妊娠SD大鼠分娩后立即麻醉，将14F导尿管插入阴道内2～3cm，往气囊注入5ml生理盐水撑开阴道，用1号手术丝线将导尿管固定于阴道口，并维持该状态4h；两周后再行上述操作一次；两周后麻醉下对其进行双侧卵巢切除术，术后连续7天注射抗生素，常规饲养两个月，获得模型大鼠。4.采用仪器BL-410生物机能实验系统检测模型大鼠最大膀胱容量、漏尿点压力等尿动力学指标，喷嚏实验阳性率，检验SUI模型大鼠建立的有效性。5.在无菌条件下取出大鼠胫骨和股骨，采用贴壁法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞;无菌条件下取足月妊娠健康胎儿脐带标本，用双酶法分离、纯化脐带间充质干细胞(UCMSCs)。两种MSCs均用含10%胎牛血清 (FBs)的DMEM/F12培养基培养。6.用流式细胞仪检测细胞表面标志，对体外传代培养的细胞进行鉴定并观察MSCs的生物学特性。7.以脂质体2000为载体，用pEGFP一1对两种Mscs进行标记，将获得的标记细胞分别注射于两组SUI模型大鼠尿道周围，常规饲养两周后用BL一410生物机能实验系统检测尿流动力学指标，并检测喷嚏实验阳性率。8.处死大鼠，进行尿道及其周围组织、耻尾肌取材，通过HE、Masson染色观察尿道及其周围组织和膀肤的病理形态学变化;在荧光显微镜下观察实验组标本切片有无绿色荧光，检验移植的间充质干细胞是否在体内成功生长增殖。结果：1.17β-E2可增强BMSCs增殖活性,且呈浓度依赖关系,最佳促增殖浓度为1nmol/L;1nmol/L 17β-E2 诱导组与对照组BMSCsDNA含量随培养时间延长均呈增加趋势( p<0.05)；而两组细胞活性随培养时间的延长均呈下降趋势,17β-E2干预组下降缓慢。2.17β-E2可增加BMSCs三种骨骼肌特异标志myogenin、MHC和desmin的表达。3.利用贴壁法和分离法可以获得高纯度的骨髓间充质干细胞,且细胞活性高。原代细胞生长相对较慢，BMSCs分离培养24h后开始少量贴壁，细胞形状呈短梭形，3d后贴壁细胞明显增多，呈集落样生长，10-14d细胞接近融合。传代后，细胞增殖、贴壁速度加快，10h后约90%以上细胞贴壁,细胞倍增时间大约为30h，7-10d细胞接近融合。4.SUI模型建立情况：模拟人类妊娠、难产产伤、密产、去势后低雌激素能获得成功稳定的动物模型。实验组和对照组大鼠：漏尿点压力值分别为10.96±0.84mmHg和28.51±0.95mmHg，（P<0.05）；最大膀胱容量分别为1.33±0.20ml和2.19±0.17ml，（P<0.05）；喷嚏实验的阳性率分别为8/15和0/20，P<0.05。5.实验组较对照组大鼠的尿道平滑肌、尿道括约肌及其周围筋膜层中胶原纤维结构松散、碎裂、呈灶性排列，染色不均。6.SUI模型尿道周围MSCs移植:实验分3组，分别为BMSCs注射组、UCMSCs注射组和PS注射组。(1)BMSCs注射组大鼠与UCMSCs注射组大鼠的最大膀胱容量(3.06士0.77&3.22士0.77)ml和漏尿点压力值(25.60士3.95&30.62士2.76)mmHg均明显高于治疗前(p<0.05)，并与阴性和阳性对照组差异无统计学意义(p>0.05)，而Ps注射组治疗前后尿流动力学指标无统计学差别(P>0.05);PS注射组最大膀胱容量和漏尿点压力均小于BMSCs注射组和UCMSCs注射组(p<0.05)，而两细胞移植组间的比较差异无统计学意义(p>0.05)。两细胞移植组喷嚏实验阳性率(16.7%)明显低于PS注射组(83.3%)。7.尿道及其周围组织行HE、Masson染色后光镜形态学观察:PS注射组与阴性和阳性对照组比较，括约肌排列松散，部分肌纤维有断裂现象，肌层变薄;筋膜间结缔组织所占比重增加，胶原纤维稀疏，排列紊乱;阴道粘膜上皮萎缩。8.尿道及周围组织切片后在荧光显微镜下观察:移植2周后，两移植组可见到绿色荧光，而其余各对照组均未见到荧光的表达，证实移植细胞在大鼠体内存活。结论：1.17β-E2对BMSCs的增殖具有促进作用，且能增强骨骼肌分化效率。2.模拟人类妊娠、难产产伤、密产、绝经建立的大鼠模型，表现可以诱发尿失禁。3.依据SUI的发病机理为建模思路，根据尿流动力学指标、喷嚏实验阳性率的差异性可建立稳定的动物模型。4.泌尿生殖道的形态学改变所致的盆底结构连接松散、张力减弱，与SUI的发生有关。5.PS注射组大鼠尿道括约肌和周围组织的不完整性，提示盆底组织结构破坏和生化改变是SUI的发生原因之一。6.大鼠骨髓间充质干细胞和人脐带间充质干细胞可以在损伤的大鼠尿道周围组织中存活、增殖，改善尿流动力学指标和喷嚏实验的阳性率;形态学上观察可修复尿道周围的支持结构。
关键词：骨髓间充质干细胞 人脐带间充质干细胞细胞培养 移植治疗 尿道注射 雌激素 增殖 分化 压力性尿失禁 大鼠 胶原 免疫组化
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